文獻賞析

上交大研究團隊揭示明星基因PTEN抗腫瘤新機制

2021/01/05


    PTEN是腫瘤研究里炙手可熱的明星分子,由于其可以通過脂質磷酸酶功能抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的活性,成為迄今最重要的腫瘤抑制基因之一。最近研究表明,缺失磷酸酶活性的PTEN突變體仍然具有較強的腫瘤抑制功能,同時,定位于細胞核內的PTEN蛋白可以通過磷酸酶非依賴途徑發揮腫瘤抑制功能。但是,目前關于核PTEN的抗腫瘤作用的分子機制知之甚少。
上海華盈生物合作伙伴——上海交通大學醫學院陳國強院士研究團隊成功運用人類蛋白質組芯片技術,發現并證實了核蛋白PTEN與剪接體蛋白的相互作用,通過影響高爾基體的伸展和分泌來發揮其腫瘤抑制作用的新機制,為PTEN基因的研究增添了濃墨重彩的一筆。相關研究成果近期發表在國際頂級學術期刊《Nature Communications》(PMCID: PMC6008332)上。

 

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文獻解讀

1、PTEN調節的選擇性剪接事件(ASE)與癌癥相關

 基因在真核生物中的表達受RNA各個環節的復雜過程的精細控制。在這些過程中,關鍵步驟之一是pre-mRNA(前體mRNA)的組成剪接形成成熟的信使RNA(mRNA)。在此過程中的另一個調控是選擇性剪接(AS),剪接是由剪接體完成,剪接體是由五個小核糖核蛋白(snRNP:U1,U2,U4,U5和U6)和200多個輔助蛋白組成的RNA和蛋白質的大復合物,剪接體的組分變化會造成基因突變或表達改變,導致疾病的發生。AS的主要作用之一是通過合成各種具有不同生物活性的蛋白質異構體使蛋白質組多樣化。AS在不同的組織和發育階段受到嚴格的控制,其調控異常與包括癌癥在內的多種人類疾病密切相關。


 PTEN作為最重要的腫瘤抑制基因之一,在剪接中發揮重要作用,為了評估PTEN對AS的潛在影響,研究人員對PTEN缺失或未缺失的293T細胞的總RNA(利用兩對shRNAs進行PTEN缺失;shPTEN#1或shPTEN#2 與非特異性shRNA作為陰性對照shNC)進行RNA-seq檢測,其中262個AS事件(ASE)代表208個人的基因檢測到顯著變化(1b)。為了確定PTEN調節的ASE是否發生在人類腫瘤中,將這262個ASE與癌癥基因組圖譜(TCGA)比較,結果顯示有80個ASE與癌癥相關(ASE頻率>5%即相關)1a),并且鑒定出20個ASE與PTEN的拷貝數相關(1c)?;谝陨戏治?,發現60%(12/20)PTEN相關的ASE也與癌癥相關(1d)。為了選擇用于深入功能分析的候選基因,對PTEN和癌癥相關的ASE進行WB和RT-PCR驗證。結果顯示共有3個ASE(對應3個基因,GOLGA2,KIF21A和C2CD5)發生選擇性剪接(1e)。

 

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圖1  PTEN調控的ASE與癌癥相關

 

2、核PTEN直接與剪接體蛋白U2AF2相互作用

 那么,PTEN是怎樣調控ASE呢?

 研究人員利用CO-IP對293T細胞核提取物進行親和純化,并通過液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析結合的蛋白質,鑒定到136個與核PTEN相互作用的蛋白質。其中,38個屬于剪接體的組成成分,包括三種主要的小核糖核蛋白(snRNP:U1,U2和U5),EJC/TREX,PRPF19-CDC5L復合物和兩類RNA結合蛋白,富含絲氨酸/精氨酸(SR)的蛋白質和核內不均一蛋白(hnRNPs)(圖2a)。


因為PTEN缺失沒有顯著改變剪接體蛋白的表達(WB圖未顯示),推測PTEN可能在剪接體組裝期間發揮作用。應用qRT-PCR檢測MEF細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)中所有五種剪接體snRNA的表達,發現在PTEN敲除時,只有U2 snRNA的豐度顯著降低,表明PTEN缺失導致剪接體組裝期間U2 snRNP的募集減少,也證實了U2 snRNP與PTEN的結合(圖2b)。


為了確定在剪接體組裝過程中PTEN調節的U2 snRNP募集的直接機制,研究人員試圖在剪接體特別是在U2 snRNP中鑒定PTEN的結合蛋白譜。為了排除PTEN與剪接體的關聯是通過RNA介導的可能性,將293T細胞的核提取物用RNase處理,CO-IP顯示所有剪接體蛋白在有無RNase存在的情況下,被PTEN抗體免疫沉淀的程度相似,表明PTEN-剪接體的關聯主要涉及蛋白質-蛋白質相互作用機制(圖未顯示)。


為找到PTEN蛋白的直接結合蛋白,研究人員與華盈生物合作,采用Huprot 20K人類蛋白質組芯片(覆蓋2萬種人類全長蛋白),鑒定出與PTEN蛋白直接結合的712種相互作用蛋白(圖2c),包括已知的PTEN相互作用蛋白USP7(HAUSP7),WWP2和APC3(CDC27)。KEGG通路分析表明PTEN結合蛋白中富集度最高的9種剪接體蛋白(圖2a),其中5種蛋白U2AF2,SF3B4,HNRNPC,HNRNPK和HNRNPU在前述的CO-IP測定的136個蛋白中也被鑒定到(圖2d),表明PTEN可以與這五種剪接體蛋白直接相互作用。其中U2AF2通常被認為在向剪接體募集U2 snRNP中起重要作用,GST pulldown結合Western blot實驗證明兩者可以直接相互作用(圖2e)。

 

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圖2  核PTEN直接與剪接體蛋白U2AF2相互作用

 

3、PTEN缺失誘導GOLGA2選擇性剪接,促進高爾基體伸展和分泌

以往研究中,PTEN從未與高爾基體相關聯。高爾基體作為細胞分泌途徑的中心細胞器,連接上游(內質網)或下游(內體,溶酶體),并在所有新合成的分泌蛋白和跨膜蛋白的翻譯后修飾、分選和運送中起重要作用。這種分泌途徑正在用于開發抗癌療法的新靶點。作為PTEN缺失引起的異常剪接導致的后果之一,GOLGA2的AS為我們提供了初步了解PTEN和高爾基體之間關系的機會。RNA-seq分析顯示293T細胞表達新的GOLGA2同種型,GOLGA2L和外顯子2b處發生剪接跳躍的GOLGA2S(圖3a)。RT-PCR表明在檢測細胞系中,GOLGA2LGOLGA2S豐度更高,且PTEN缺失導致細胞中GOLGA2S的含量顯著增加(圖3b)。此外,U2AF2的敲低也會誘導GOLGA2在外顯子2b處發生剪接跳躍(圖3c),表明外顯子2b是由PTEN和U2AF2共同調控。因此,PTEN的缺失破壞了U2AF2的募集,導致剪接體的結構不完整,結果是GOLGA2發生剪接跳躍。外顯子2b剪接跳躍的結果是高爾基體池厚度減少,延伸更長(圖3d,3e)。接著利用ts045-VSVG-EGFP(具有從ER移出到高爾基復合體中的能力,并且在溫度降低到32℃時最終到達質膜,因此已被廣泛用于研究膜轉運)研究高爾基體分泌,結果顯示PTEN缺失促進高爾基體分泌(圖3f)。

 

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圖3  PTEN通過GOLGA2外顯子2b剪接調控高爾基體伸展和分泌


4、PTEN缺失使癌細胞對分泌抑制劑敏感

研究人員進一步研究了GOLGA2S對腫瘤生長的影響。發現PTEN缺失促進腫瘤生長,敲低GOLGA2S也會抑制這種生長現象(圖4a,4b),因此GOLGA2剪接有助于PTEN缺失誘導的分泌和腫瘤生長。接著研究人員用兩種分泌抑制劑BFA和GCA處理PTEN+/+PTEN-/-MEF細胞。結果顯示,一旦達到一定的濃度(BFA為1μg/ ml,GCA為8μg/ ml),BFA和GCA對PTEN-/-細胞抑制作用更明顯,表明分泌抑制劑BFA和GCA能夠選擇性地殺死PTEN缺失的腫瘤細胞(圖4c)。

 

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圖4  PTEN刪除使癌細胞對分泌抑制劑敏感

 

小結

在本研究中,利用人類蛋白組芯片技術找到PTEN的直接結合蛋白U2AF2對于揭開核PTEN抗腫瘤機制的大幕十分關鍵。作者先后嘗試過CO-IP結合質譜、酵母雙雜交等經典的實驗策略,均未得到有意義的創新性結果。利用華盈生物推出的人類蛋白組芯片技術,2周內便獲得712種PTEN直接結合蛋白,效率之高超過所有傳統技術。人類蛋白組芯片在篩選互作蛋白研究中具有如下特征性優勢:

1. 芯片實驗為體外實驗,芯片上每個蛋白點相互獨立,保證篩選到的互作蛋白均為目標蛋白的直接結合蛋白,數據分析簡單。

2. 體內環境復雜,很多蛋白結合現象稍縱即逝,很難捕捉,利用體外環境條件下的篩選,可以很快發現很多潛在結合靶標,結合每個蛋白的生物學功能再進行后續實驗驗證的實驗策略更加高效,數據也更加全面。

3. 在不同組織、細胞、細胞器中,蛋白的表達豐度差異很大,傳統的CO-IP等實驗很難發現低豐度蛋白的互作現象,人類蛋白組芯片上的蛋白是酵母純化表達的蛋白,可以保證每種蛋白的豐度,芯片實驗容易發現潛在蛋白互作現象。

4. 利用人類蛋白組芯片實驗篩選互作蛋白,從蛋白質層面分析互作數據,避免了CO-IP后質譜鑒定時,從多肽水平跨層分析互作蛋白的不確定性和復雜性。

5. 相比酵母雙雜交實驗,蛋白芯片實驗周期短、假陽性率低,方便復雜實驗設計,可以設計多種實驗對照,更能確?;プ鞯鞍讛祿臏蚀_性。

 

英文文獻鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41467-018-04760-1



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