文獻賞析

高分文章策略二:血漿靶向檢測組織來源的蛋白標志物

2020/11/16

血漿/血清蛋白標志物的檢測已經應用在多種癌癥及疾病的臨床診斷中。在血漿/血清蛋白標志物篩選階段,很多研究是通過蛋白質譜的方法直接鑒別疾病患者血漿/血清中的蛋白,通過和對照組別的比較,篩選出疾病患者特異性的血漿/血清蛋白作為標志物。但是這類研究會受到諸多因素的影響,例如樣本的收集、處理和儲存方式。另外一個重要的阻礙是血漿高豐度蛋白對質譜實驗的干擾,其中有22個蛋白占據了血漿總蛋白量的99%。雖然某些高豐度蛋白也反映了一些有意義的生物學現象,但是這些蛋白的改變很可能是機體整體狀態變化的結果,這些蛋白并不是直接來源于病原灶組織,而病原灶組織分泌到血漿中的蛋白含量很低。雖然目前幾種去高豐度蛋白的方法已被普遍應用,但是利用質譜技術在血漿/血清中鑒定低豐度蛋白仍然是一個挑戰。另外血漿蛋白容易受到外界因素影響,例如個體健康狀態,生活方式和性別等的影響1。這些累計的因素造成了血漿蛋白組極其復雜的特征,阻礙了在血漿/血清中直接篩選反映疾病組織真實狀態的標志物。為了解決這些問題,很多標志物研究的策略是在血漿中靶向檢測疾病組織來源的蛋白標志物2。那么如何設計這樣研究方案呢?今天華盈視角就和大家一起分享兩個相關的精彩案例,和大家一起學習。



 

 

案例一  動脈粥樣硬化組織蛋白組及血漿蛋白標志物的篩選

此項研究在研究思路、樣本收集、數據分析和后續標志物的篩選階段是非常值得大家學習借鑒的。特別是該研究的樣本并不是從真正意義上臨床病人獲取,而是直接對無臨床疾病診斷的尸檢解剖組織進行病理分析,再開展蛋白組和標志物研究。雖然這種方式的樣本收集并不容易,但是這種策略尤其對篩選疾病早期診斷標志物具有借鑒意義。此項研究2018年發表于心血管領域頂級期刊Circulation雜志(IF:23.603)3。

研究者首先對收集的100個尸檢個體的左前降支冠狀動脈(LAD)和腹主動脈(AA)組織分為了3個病理狀態:正常(NL),脂肪紋(FS),纖維斑塊(FP)。病理學結果展示了所有的纖維斑塊幾乎都是早期病變,同樣死者生前也都沒有被診斷為冠狀動脈疾病。研究者對LAD和AA組織進行了label free蛋白質譜分析。質譜鑒定了LAD和AA組織中總共1925和1495個蛋白, 其中944個蛋白和725個蛋白分別可在50%的LAD和AA樣本中被鑒別(圖1A),這些缺失值少于50%的蛋白后續進行了WGCNA分析(圖1B),發現了這些LAD和AA組織中的蛋白形成了相似的共表達模塊,例如細胞呼吸相關的線粒體蛋白,染色體組裝相關的核蛋白以及胞外基質蛋白,說明了動脈組織相關疾病的蛋白標志物很大部分來源于這些模塊中富集的蛋白。

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圖1 動脈粥樣硬化組織蛋白組特征。

A.統計缺失值少于50%的蛋白,B. WGCNA分析

研究者接著利用多種回歸性分析convex analysis of mixtures(CAM)方法鑒別了分別與NL,FS,FP每種表型相關的特征性蛋白。PCA分析也表明這些特征性蛋白可以在LAD組織中區分這3種表型(圖2A)。研究者分別比對了LAD和AA組織中FP和NL蛋白組的差異,在LAD和AA組織中分別鑒別了89個和166個差異性蛋白(FC≥ (+/–)1.7; q-value ≤0.05),研究者又通過IPA分析發現了LAD組織差異蛋白的功能與TNF-α通路的激活,以及和胰島素通路,PPAR-α、PPAR-γ通路的抑制相關(圖2B),但是AA組織差異蛋白的功能僅與TNF-α通路的激活有關,與其他通路并沒有實質性的關聯,說明了胰島素通路,PPAR-α、PPAR-γ通路相關蛋白的變化或許可以用來鑒別動脈粥樣硬化是否發生在LAD或者AA組織。

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圖2 比較LAD組織中FP和NL的蛋白組

為了驗證組織差異蛋白是否能夠成為診斷動脈粥樣硬化血漿標志物的來源?研究者在45個女性冠狀動脈粥樣硬化患者和41個對照女性患者血漿中對組織中38個和FP最顯著相關的蛋白進行了MRM-MS分析。其中5個蛋白DRB1, LCP1, RNASE1, MTHFD1和CALU由于在血漿中沒有可檢測的多肽而剔除,然后研究者利用Skyline軟件對剩余33個蛋白的86個多肽的323個碎片進行優化。在對MRM數據分析中,8個蛋白CATB, TSP1, NNMT, S100A9, ITIH2, POSTN, CORO1A和HTRA由于很低的信號比被排除,所以最終25個蛋白被定量作為潛在標志物(圖3A)。ROC分析也表明了這些潛在標志物可以很準確的診斷冠狀動脈疾?。ˋUC=0.93)(圖3B)。這些結果再次驗證了來源于疾病組織的蛋白可以在血漿中被檢測,并且早期疾病組織表達的蛋白可以作為疾病診斷的標志物。
這個案例的亮點是通過正常組織篩選蛋白,然后分析和尋找冠狀動脈相關的蛋白,最后在血漿中用進行檢測。組織蛋白組不僅局限于揭示疾病發生機制,而且還可以作為血漿標志物的來源。這個案例為標志物的研究提供了強有力的證據,先通過組織蛋白組篩選疾病相關的蛋白,然后在病人血漿通過MRM檢測。最重要的是這些組織蛋白可以在血漿中被高效的檢測到(25/38),這個結果給標志物研究提供了新的啟示。

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圖3 血漿MRM驗證組織來源的標志物


案例二   補體蛋白C5作為亞臨床動脈粥樣硬化的標志

本研究分為發現集和驗證集兩個階段篩選和驗證動脈粥樣硬化早期的標志物。研究者總共納入了799個受試者,發現集階段此項研究和上述的案例采取相似的方法,收集了尸檢的9個健康對照,7個脂肪紋(FS)患者和11個纖維斑塊(FP)患者的腹主動脈組織中膜,另外又收集6個脂肪紋(FS)患者和12個纖維斑塊(FP)患者的腹主動脈組織內膜開展標記定量TMT蛋白組學研究。在驗證集階段,研究者納入了兩個獨立的人群,通過ELISA檢測血漿中的待選標志物(圖4)。此項研究在2020年發表于心血管領域的頂級期刊J Am Coll Cardiol(IF:20.589)4。

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圖4.研究方案

TMT蛋白質譜在動脈中膜和內膜中總共鑒定了6500個蛋白,其中蛋白多肽大于1,在超過60%樣本中可被鑒別的蛋白被定量分析,包括動脈中膜總共3079個蛋白,內膜3332個蛋白,其中有2660個蛋白是中膜和內膜共有的蛋白。和健康的動脈中膜相比,FS中膜含有340個差異蛋白,FL中膜含有328個差異蛋白。和FS內膜相比,FL內膜含有577個差異蛋白。功能富集分析發現了中膜和內膜中這些差異的蛋白都顯著性富集到補體、脂轉運和凝血通路,并且這些通路中蛋白的富集程度會隨著疾病的進展而升高,在健康動脈中膜中含量最低,在FS中膜,FL中膜,FS內膜,FL內膜中蛋白豐度依次逐漸升高(圖5A)。說明了這些通路蛋白在動脈粥樣硬化的發生中發揮著關鍵作用。另外相關性分析顯示了內膜中補體系統蛋白的豐度與其他的通路蛋白豐度間都呈現正相關(圖5B),說明補體蛋白的改變可能是一個主導的因素。

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圖5 動脈中膜和內膜蛋白組分析A. 從左到右:補體,脂轉運,凝血,B.相關性分析

研究者接著更深入的分析了補體系統在FL內膜中的變化情況,結果發現了相比其他補體蛋白,“補體激活”相關的蛋白豐度在FL內膜中是最多的(圖6A),其中最顯著的是C3和C5蛋白(FL內膜 vs FS 內膜,FDR<0.05)(圖6B)。研究者選取了C5作為候選標志物驗證,首先通過western blotting和免疫組化驗證了C5在FL內膜中表達最高(圖6C),并且 ELISA也驗證C5在FL內膜組織體外培養上清中的含量最高(圖6D)。

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圖6. 組織驗證C5的表達

最后研究者采取利用ELISA方法檢測了2個亞臨床動脈粥樣硬化人群血漿中C5的表達。每一個研究隊列都通過影像學分析斑塊的數量分為了2組:早期患者(0-2個)和泛發期患者(>2個)。ELISA檢測結果表明了泛發期患者血漿中的C5含量顯著高于早期患者。通過邏輯回歸和多元線性回歸分析也說明了C5可作為亞臨床動脈粥樣硬化獨立的預測指標,與斑塊負荷和冠狀動脈鈣化程度具有顯著相關性(圖7)。

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圖7. 血漿C5蛋白可獨立作為亞臨床動脈粥樣硬化的指標

 

小結

兩個精彩的案例為大家勾畫出了血漿靶向檢測組織蛋白標志物的研究思路和技術路線,大家可以參考將組織樣本和血漿或者其他體液樣本聯合起來研究,這樣的標志物研究由于得到了病原組織的證據支持,是更容易被Top期刊接收的。另外,組織蛋白組的篩選還可以為進一步的機制研究提供豐富的數據支撐,可謂是一舉兩得。好的思路值得華盈視角的解讀和推薦,大家可以趕快行動起來了!

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相關文獻

1. Nedelkov D, Kiernan UA, Niederkofler EE et al., Investigating diversity in human plasma proteins. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(31):10852-10857.  

2. Zhang H and Chan DW. Cancer biomarker discovery in plasma using a tissue-targeted proteomic approach. [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007;16(10):1915-1917. 

3. Herrington DM, Mao C, Parker SJ et al., Proteomic Architecture of Human Coronary and Aortic Atherosclerosis. [J]. Circulation. 2018;137(25):2741-2756. 

4. Martínez-López D, Roldan-Montero R, García-Marqués F et al., Complement C5 Protein as a Marker of Subclinical Atherosclerosis. [J]. J Am Coll Cardiol. 2020;75(16):1926-1941.

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