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    凝集素蛋白芯片

           
            凝集素(Lectin是一類自然界廣泛存在的蛋白質,具有特定糖結構識別的特性。糖蛋白和糖脂上發生的糖基化修飾,在細胞分化、病原微生物侵襲,以及腫瘤的發生、發展和遷移等生物現象中扮演著極為重要的角色。利用凝集素進行特定糖結構的解析是糖生物學研究領域的常用手段。本芯片將可商業獲得的多種經典凝集素,以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上,形成高通量凝集素芯片,可進行多種糖結構的同步篩選和交叉驗證。該芯片的誕生為專注于分析細胞表面糖基化及蛋白質糖基化研究的科學家提供了較好的工具。

     

    Sharon N,et al.Glycobiology. 2004

    凝集素芯片列表


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    凝集素芯片應用

     

    1. 特定蛋白表面糖譜構建及差異檢測;
    2. 活細胞表面糖譜構建及差異檢測;
    3. 細胞或組織裂解液糖譜構建及差異檢測;
    4. 臨床樣本的糖譜檢測與生物標志物發現;
    5. 與質譜技術聯用研究糖基化蛋白質組。

     

     

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    凝集素芯片實測結果(以70種凝集素為例)

           
            如芯片掃描圖所示,BANLEC、BC2L-A、CALSEPA、GNA、HHA、NPA、PA-IIL和PALA凝集素與生物素標記的HRP孵育后呈強熒光信號。已知這八種凝集素可以和甘露糖進行特異性結合,且后續分別以梯度增加HRP/甘露糖濃度進行實驗,結果顯示,結合的熒光信號都隨濃度的增加而減弱,進一步表明HRP蛋白中含有甘露糖結構(與芯片上的凝集素進行特異性結合)。另外, AAL和RS-FUC兩種凝集素(與巖藻糖特異性結合)也顯示出與HRP的強相互作用,表明HRP發生巖藻糖基化。

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    不同類型樣品凝集素芯片實測結果展示:


    不同類型樣本實測結果.gif



    凝集素芯片應用案例

          
            上海兒童醫學中心檢驗科楊藺主任與華盈生物研發團隊、上海交通大學陶生策教授課題組一起展開合作,以社區獲得性肺炎為研究對象,通過凝集素芯片篩選血清糖基化譜,進一步結合質譜分析,找到潛在的肺炎血清診斷糖蛋白標志物HPR,有助于對兒童非細菌性肺炎與細菌性肺炎的鑒別診斷,相關研究成果發表在學術期刊《Proteomics - Clinical Applications》上。

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            該研究的論文作者有多名來自華盈生物研發團隊,成功應用了華盈生物新建立的凝集素芯片-標志物研發方案,綜合了蛋白芯片與質譜兩種蛋白組學技術,為復雜疾病的臨床標志物開發提供了新的研究思路,具有借鑒意義。也充分體現了華盈生物專業化技術服務的理念與研發實力。

    糖蛋白研究一體化方案:

     

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    1步:明確研究目的

            社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是兒童(尤其是嬰幼兒)常見感染性疾病,也是5歲以下兒童死亡的首位病因。CAP常見病原體包括細菌、病毒、支原體、衣原體等。但不同病原體感染的嬰幼兒早期癥狀無明顯差別,傳統的診斷方法存在不足,難以實現早期及時有效的診斷,因而臨床上以經驗性的廣譜抗生素治療為主,導致耐藥以及部分患兒未及時針對性用藥而延誤病情的風險增加。因此臨床上兒童肺炎尚缺乏有效的早期鑒別診斷標志物。

     
    2步:凝集素芯片助力血清糖基化譜篩選

           由于蛋白糖基化修飾的廣泛性,無論病理條件下特定蛋白本身數量發生變化,還是糖基轉移酶調控的修飾程度、類型發生變化,都可能導致樣品中糖鏈“標簽”的差異累積并呈現在整體水平上。而凝集素就是一種可以識別這類“標簽”的工具蛋白,制備成蛋白芯片后大大提高了可以同時檢測的“標簽”通量(詳見后文介紹),因此研究人員從蛋白糖基化篩選入手,應用凝集素芯片對正常兒童(NC)、支原體肺炎患兒(M)和細菌性肺炎患兒(B)的血清糖基化譜進行篩選。芯片結果顯示,有4個凝集素(CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I)在不同組間有明顯的差異結合信號,在總體水平上反映出不同血清樣品中特定蛋白糖鏈的豐度差異。

     

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    圖1  凝集素芯片篩選糖基化譜


    3步:
    凝集素芯片結果驗證與延伸       
            其中,研究人員選取SNA-I進行lectin blot實驗對篩選結果進行驗證。和芯片檢測一致,結果顯示支原體肺炎組檢測信號明顯高于正常對照組和細菌性肺炎組。進一步發現,差異結合信號集中在42 kDa分子量附近,推測該分子量附近的蛋白可能有糖基化的上調或者蛋白表達量的上調。因此研究人員結合考馬斯亮藍染色結果進行分析,發現支原體肺炎組中42 kDa附近蛋白表達量有明顯增加,并且和SNA-I的結合信號差異相關性很高(見圖2),由此推測SNA-I結合信號的差異可能是由于42 kDa附近蛋白表達量增加導致的。

     

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    圖2  lectin blot驗證凝集素芯片結果

     
    4步:關鍵糖蛋白鑒定

           為了進一步明確是哪個蛋白的表達量發生了上調,研究人員以凝集素SNA-I為釣餌,進行了pull down實驗。血清pull down產物(P-M3)經電泳分離后,對42 kDa分子量附近的蛋白條帶進行了質譜鑒定。結果顯示,高同源性蛋白HP和HPR的鑒定分值最高。隨后通過western blot驗證,發現HPR在支原體肺炎組(M組)中表達量明顯上調,如圖3。


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    圖3  HPR可能是潛在的肺炎診斷標志物 


    5步:HPR標志物評判

           最后,研究人員應用western blot技術對更多例數的血清樣品進行檢測。結果顯示:肺炎組的HPR水平要高于健康對照組(p<0.001),并且與細菌性肺炎組相比,HPR表達水平在非細菌性肺炎組(支原體肺炎組和病毒性肺炎組)更高(p<0.05),如圖4。表明HPR可以作為潛在的兒童肺炎診斷指標,并且具有針對兒童細菌性肺炎與非細菌性肺炎的鑒別診斷的潛力。



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    圖4  HPR標志物評判

    凝集素芯片文獻

    1. Yang L, et al. Lectin Microarray Combined with Mass Spectrometry Identifies Haptoglobin-Related Protein (HPR) as a Potential Serologic Biomarker for Separating Nonbacterial Pneumonia from Bacterial Pneumonia in Childhood. Proteomics Clin Appl. 2018: e1800030. (上海兒童醫學中心)
    2. Xin AJ, et al.
    Lectin binding of human sperm associates with DEFB126 mutation and serves as a potential biomarker for subfertility .Sci Rep-UK, 2016, 6(1): 20249.    (復旦大學生殖與發育研究院)
    3. Zhou S M, et al.
    Lectin RCA-I specifically binds to metastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res, 2015, 17(1): 36.  (上海交通大學)
    4. Tan Z, et al.
    Altered N-glycan expression profile in epithelial-to-mesenchymal transition of NMuMG cells revealed by an integrated strategy using mass spectrometry and glycogene and lectin microarray analysis. J Proteome Res, 2014, 13(6): 2783-2795.
    5. Bird-Lieberman E L, et al.
    Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus. Nat Med, 2012, 18(2): 315-321.
    6. Liu Y, et al.
    Identification and confirmation of biomarkers using an integrated platform for quantitative analysis of glycoproteins and their glycosylations. J Proteome Res, 2009, 9(2): 798-805.
    7. Tao S C, et al.
    Lectin microarrays identify cell-specific and functionally significant cell surface glycan markers. Glycobiology, 2008, 18(10): 761-769.